El análisis más detallado de la estructura del ADN consiste en averiguar la secuencia exacta de los nucleótidos que lo conforman.
Se han desarrollado diferentes métodos para llevar a cabo esta tarea, como la secuenciación tipo Sanger por electroforesis capilar automatizada que permite visualizar regiones discretas del ADN (longitudes de hasta 1000 nucleótidos por experimento) para estudiar, validar o descubrir variantes tipo SNP, microsatélites o indels.
En los últimos años han surgido nuevos procedimientos denominados Next-Gen Sequencing (NGS) que permiten obtener la información de los genomas en mucho menor tiempo y con una mayor profundidad y certeza en el orden de los nulceótidos.
*NOTA: En esta Unidad se reciben los ácidos nucleicos ya extraídos y purificados, no se realizan extracciones de DNA; favor de referirse a la sección de Laboratorio de Diagnóstico Genómico si está interesado en servicio de extracción de DNA.
Se ofrecen servicios de secuenciación capilar tradicional (Sanger), preparación y cuantificación de bibliotecas genómicas y secuenciación de alta profundidad con tecnologías de secuenciación de segunda generación (NGS); además de apoyo técnico personalizado para la elección de la plataforma ideal para el proyecto de investigación que se desee desarrollar.
Re-secuenciación de genes o regiones genómicas
La Secuenciación por electroforesis capilar es la principal técnica de secuenciación de ADN que ha sido utilizada en laboratorios de investigación en ciencias de la vida y la re-secuenciación de regiones discretas mediante está técnica es de las aplicaciones más populares para determinar variantes genéticas entre dos o más muestras o con referencias predeterminadas. El tamaño de la secuencia que se obtiene varia entre 100 y 1000 pb dependiendo del tamaño del inserto o amplicón.
Requerimientos de la muestra:
20 ul de producto de PCR 10ng/ul ó 20 ul de plásmido 100ng/ul; Rel. 260/280 ≥ 1.8; Rel. 260/230 ≥ 1.8.
Requerimientos de los primers: 5 ul de primer 10uM por reacción; Rel. 260/280 ≥ 1.8; Rel. 260/230 ≥1.8
Requerimientos de los primers:
5 ul de primer 10uM por reacción; Rel. 260/280 >1.8; Rel. 260/230 >1.8
Análisis de fragmentos
El Análisis de Fragmentos consiste en la separación por electroforesis capilar de fragmentos fluorescentes de ADN generados y marcados previamente mediante amplificación por PCR de una región específica. Permite identificar inserciones, deleciones y variaciones en el número de copias.
Requerimientos de la muestra:
20 ul de reacción de PCR (marcada con fluorescencia)
Secuenciación de regiones metiladas
La secuenciación capilar de regiones metiladas permite determinar los patrones de metilación de muestras de ADN tratadas previamente con bisulfito. En presencia de bisulfito los residuos de citosina no metilados son convertidos a uracilo mientras que las citosinas metiladas se mantienen intactas. La conversión es detectada por métodos convencionales de secuenciación capilar.
Requerimientos de la muestra:
20 ul de ADN convertido 10ng/ul; Rel. 260/280 ≥1.8; Rel. 260/230 ≥ 1.8.
Requerimientos de los primers:
5 ul de primer 10uM por reacción; Rel. 260/280 ≥ 1.8; Rel. 260/230 ≥ 1.8 (uso de primers diseñados para conversión)
Secuenciación directa a partir de muestras genómicas
La secuenciación directa es un método para secuenciar regiones específicas de ADN que combina Amplificación por PCR, Purificación y Secuenciación Capilar en un solo tubo de reacción a partir de muestras de ADN total. Reduce el tiempo de preparación y en la obtención de los resultados, además no requiere de técnicas adicionales de purificación de ácidos nucleicos.
Requerimientos de la muestra:
3 ul de ADN genómico 4ng/ul; Rel. 260/280 ≥ 1.8; Rel. 260/230 ≥ 1.8.
Requerimientos de los primers:
ul de cada primer 0.8uM por muestra; Rel. 260/280 ≥ 1.8; Rel. 260/230 ≥ 1.8 (en cada primer se deben considerar las regiones M13 para la secuenciación)
Secuenciación De novo
Con la secuenciación De novo generamos una secuencia genética primaria de un organismo que no haya sido caracterizado previamente. La nueva información permite indagar sobre la biología del organismo y también es utilizada para estudios de genómica comparativa. El ADN total es fragmentado al azar y preparado para la secuenciación. Se requiere de alta profundidad de secuencia.
Re-secuenciación de genomas
La re-secuenciación, especialmente de muestras humanas, es utilizada para determinar las variaciones genómicas de una muestra en relación a secuencias referencia disponibles. La secuencia es alineada a una referencia para identificar SNPs, CNVs, InDels y reordenamientos genómicos en cada muestra. El ADN total es fragmentado al azar y preparado para su secuenciación.
Exoma
La re-secuenciación de paneles involucra el aislamiento de regiones genómicas de interés permitiendo una reducción sustancial en los costos de secuenciación para la detección de variantes somáticas y germinales. Existen paneles prediseñados para secuenciar exoma completo, grupos de genes relacionados a determinados padecimientos o grupos de genes de selección personalizada. El aislamiento es mediante captura por hibridación o por métodos basados en amplificación por PCR.
Secuenciación de transcriptoma completo
Es la aplicación de análisis de transcriptoma que permite examinar todos los transcritos presentes en una muestra de RNA total, incluyendo RNA codificante y no codificante. Para esta aplicación es necesario eliminar previamente toda la fracción de RNA ribosomal (95-98% del RNA total) con el fin de obtener una mayor cantidad de secuencia útil.
Metagenómica y 16s rDNA
En estudios con enfoque metagenómico, el ADN aislado de muestras ambientales es fragmentado para generar bibliotecas genómicas estándares para su secuenciación e identificación de genes y genomas presentes en cada muestra. También existe la opción de secuenciar por métodos basados en amplificación por PCR pequeñas regiones del ADN bacteriano (16s ARN ribosomal) para identificar con gran precisión las especies presentes en cada muestra evaluada.
Análisis de patrones de metilación (Epigenómica)
La secuenciación de nueva generación ha permitido la transición para estudiar patrones de metilación de sólo algunos genes hasta estudios genómicos globales dando lugar a una mayor visión sobre el metiloma. Las muestras de ADN son tratadas previamente con bisulfito. En presencia de bisulfito los residuos de citosina no metilados son convertidos a uracilo mientras que las citosinas metiladas se mantienen intactas. El ADN convertido es fragmentado al azar y preparado para la secuenciación. Se requiere de alta profundidad de secuencia.
Re-secuenciación de páneles prediseñados
La re-secuenciación de paneles involucra el aislamiento de regiones genómicas de interés permitiendo una reducción sustancial en los costos de secuenciación para la detección de variantes somáticas y germinales. Existen paneles prediseñados para secuenciar exoma completo, grupos de genes relacionados a determinados padecimientos o grupos de genes de selección personalizada. El aislamiento es mediante captura por hibridación o por métodos basados en amplificación por PCR.
Re-secuenciación de páneles la medida
La re-secuenciación de paneles involucra el aislamiento de regiones genómicas de interés permitiendo una reducción sustancial en los costos de secuenciación para la detección de variantes somáticas y germinales. Existen paneles prediseñados para secuenciar exoma completo, grupos de genes relacionados a determinados padecimientos o grupos de genes de selección personalizada. El aislamiento es mediante captura por hibridación o por métodos basados en amplificación por PCR.
ChIp-Seq
La aplicación ChIP-Seq permite analizar las interacciones proteína-ADN. La técnica consiste en preservar las asociaciones in vivo entre ambas moléculas, fragmentar el DNA expuesto y seleccionar por inmunoprecipitación los fragmentos de ADN asociados a la proteína de interés. El ADN es purificado y preparado para la secuenciación.
Secuenciación de mRNAs
La secuenciación de mRNA consiste capturar los mRNA poli-adenilados para evaluar los niveles de expresión de cada transcrito. Los mRNAs son capturados mediante sondas oligodT magnéticas a partir de muestras de RNA total. El mRNA enriquecido es fragmentado e inmediatamente convertido a cDNA para su secuenciación.
Secuenciación de RNAs pequeños
Los RNAs pequeños maduros son estructuralmente distintos al resto de las moléculas que componen el transcriptoma y tienen un tamaño definido entre 20-30 pb. Presentan un extremo 5’ monofosfato requerido para poder ligar uno de los adaptadores necesarios para la construcción de una librería. En ambos extremos de cada RNA pequeño son ligados adaptadores para la generación de cDNA de doble cadena mediante la técnica de RT-PCR. El ADN resultante está listo para la secuenciación y análisis todas las especies de RNAs pequeños presentes en una muestra.
Secuenciadores capilares de 1 a 96 secuencias por corrida
MiSeq, Illumina
Secuenciador de nueva generación output de 15Gb, lecturas de 2x300pb y 25 lecturas.
454 GS FLX+ System de Roche, 2da Generación
Pirosecuenciación, secuenciación por emisión de luz, no. de secuencias por corrida: 1x106, tamaño de secuencias: hasta 1000nt, capacidad: 1Gb.
NextSeq 500. Secuenciación por síntesis y detección de fluorescencia con capacidad para secuenciar un genoma humano completo en 29 horas. Otras aplicaciones: estudios de perfiles de expresión génica, RNA-seq, páneles de enriquecimiento y secuencias de exoma completo.
PGM Ion Torrent de Life Technologies, 2da Generación
Secuenciación por síntesis en chip semiconductor, no. de secuencias por corrida: 11x106 , capacidad: 1Gb.
