En este laboratorio se hacen experimentos para estudiar proteínas. La Proteómica es el estudio de todas las proteínas presentes dentro de una célula en un momento y bajo condiciones específicas de ambiente determinado en su desarrollo.
Las proteínas derivadas de células, componentes celulares, tejidos y biofluidos, se cortan en fragmentos más pequeños llamados péptidos, que son analizados por Espectrometría de Masas.
Los espectros de masa obtenidos son procesados mediante algoritmos matemáticos que permiten la identificación y cuantificación de las proteínas en las muestras.
La espectrometría de masas ha permitido la multiplicación espectacular del número de proteínas que se pueden identificar en un único análisis.
En el 2011, se publicó el proteoma completo de levadura y poco después se ha conseguido la cobertura completa de dos líneas celulares humanas. Estos resultados demuestran por primera vez, que el proteoma entero de células humanas está al alcance de la tecnología actual.
Actualmente, no existe ninguna duda acerca de que el estudio del proteoma tendrá un enorme impacto en todas las áreas de las ciencias de la vida, ya que para entender todos los procesos biológicos, se necesita comprender qué proteínas se encuentran presentes, en qué cantidad y cómo funcionan dentro de las células en diferentes etapas de crecimiento o condiciones metabólicas (como salud y enfermedad).
*NOTA: En esta unidad no se extraen las proteínas de ninguna muestra, sólo se reciben los extractos proteicos previamente obtenidos por el usuario.
Geles de una dimensión
Minigeles desnaturalizantes (7cm) que separan proteínas de acuerdo a su peso molecular; basados en electroforesis en acrilamida al 12% en el gel separador y 4% en el gel concentrador para evaluación de integridad de las muestras de extractos proteicos; se incluye marcador de peso molecular estándar y pueden ser 10 o 15 carriles, de acuerdo a las necesidades del usuario. Se manejan diferentes tipos de tinción de acuerdo a la cantidad de muestra a analizar: Coomassie (límite de detección aproximadamente 50ng), tinción fluorescente con Sypro (límite de detección aproximadamente 1ng).
Geles bidimensionales
Geles desnaturalizantes de diferentes formatos (7, 18 y 24 cm) que separan proteínas por punto isoeléctrico mediante un isoelectroenfoque en tiras de archilamida y posteriormente se separan de acuerdo a su peso molecular; basados en electroforesis en acrilamida al 12% se incluye marcador de peso molecular estándar. Se manejan diferentes tipos de tinción de acuerdo a la cantidad de muestra a analizar: Coomassie (límite de detección aproximadamente 50ng), tinción fluorescente con Sypro (límite de detección aproximadamente 1ng).
Electroforesis diferencial en gel (DIGE)
Técnica multiplex de tinción covalente de proteínas que permite analizar dos muestras y un control interno en el mismo gel. Para hacerlo se marcan con Cy2, Cy3 y Cy5 las muestras de diferentes extractos celulares protéicos y el control interno que son posteriormente separados por isoelectroenfoque y después por peso molecular para determinar el patrón de diferencias entre las muestras a analizar.
Requerimientos para geles 2D-DIGE
- Se recomienda hacer la extracción de las muestras (células o tejido) en buffer de lisis 2D (7 M urea, 2 M thiourea, 4% CHAPS, 30 mM Tris-HCl, pH 8.8), si no se cuenta con el buffer recomendado, nosotros podemos proporcionarlo con un costo extra, el cual dependerá del volumen que se necesite. Si las proteínas fueron extraídas con un buffer diferente, se debe especificar el contenido para detectar posibles sustancias que puedan interferir con el marcaje y la segunda dimensión.
- Las muestras deberán estar en una concentración aproximada de entre 2 y 8 ug/ul y deberán ser almacenadas a -80°C.
- Previo a la cuantificación de las muestras, es muy importante eliminar las sales de las muestras por algún método elegido por el usuario o bien, este proceso se puede realizar en la Unidad considerando un costo extra.
- Las muestras se recibirán solamente en hielo seco.
- Las muestras deberán ser cuantificadas por el método 2D Quant, el cual se realiza en la Unidad y el costo dependerá del número de muestras.
- Una vez cuantificadas las proteínas, se realiza un gel SDS-PAGE para evaluar la integridad de las muestras y validar la cuantificación de las mismas.
- Para la realización de geles analíticos de MARCAJE MÍNIMO (3 CyDye) se requieren aproximadamente 90 ug de proteína por cada muestra y para cada gel preparativos se requieren de 750 ug de proteína, por lo que se pide un total de 500 ug de proteína por cada muestra que se desee analizar.
- Para la realización de geles analíticos de MARCAJE SATURADO (2 CyDye) se requieren aproximadamente 25 ug de proteína por cada muestra y para cada gel preparativos se requieren de 300 ug de proteína, por lo que se pide un total de 350 ug de proteína por cada muestra que se desee analizar.
NOTA: Dependiendo del número de geles preparativos extra que el usuario desee, la cantidad de muestra total requerida puede incrementar.
Limpieza de muestras (extractos de proteínas)
Se somete a los extractos protéicos entregados por el investigador a una precipitación que permite separar a las proteínas de los contaminantes más comunes como sales, ácidos nucleicos, lípidos, etc. Con el fin de contar con un extracto proteico que no interfiera con los procedimientos siguientes, como por ejemplo isoelectroenfoque.
Cuantificación de muestras (extractos de proteínas)
Se cuenta con dos diferentes tipos de cuantificación para muestras que se encuentran resuspendidas en buffers de rehidratación para isoelectroenfoque que no son fácilmente cuantificables por los métodos tradicionales debido a la intervención de los componentes de dichos buffers; y se cuenta con un método modificado de cuantificación por Lowry.
Depleción de albúmina e IgGs de muestras de suero o plasma
Procedimiento cromatográfico, mediante el cual se elimina la albúmina y las IgGs de muestras de suero y plasma mediante el uso de columnas de afinidad.
Requerimientos para depleción de Albúmina e Inmunoglubulinas de muestras de suero y plasma.
- Las muestras sólo serán recibidas en hielo seco y debidamente etiquetadas con letra legible.
- Se requiere un volumen total de 200 ul de plasma o suero por cada muestra a depletar y debe estar delipidada.
Análisis de geles bidimensionales
A través de este análisis, se obtiene información estadística y semi-cuantitativa de las diferencias entre condiciones experimentales de geles DIGE. Con ello se pueden seguir estudiando proteínas que indiquen diferencias significativas entre dos condiciones y con ello poder proponerlas como biomarcadores de algún estado metabólico o padecimiento.
Identificación de proteínas por espectrometría de masas en spots de geles bidimensionales (MALDI TOF/TOF)
Para el servicio de identificación de proteínas mediante espectrometría de masas se realiza desde el corte del gel, la destinción del spot, la extracción de la proteína del spot, la digestión de la proteína, la limpieza cromatográfica de la muestra, su tratamiento con matriz y se entrega como resultado la lista de posibles candidatos y los porcentajes de cobertura para cada uno.
Requisitos de la muestra:
- Es indispensable que el gel sea recién hecho (no más de un mes de antigüedad)
- Es indispensable que esté teñido con coomassie y se tenga una asesoría con el responsable de la parte Proteómica de la Unidad para evaluar la cantidad de spots requeridos para asegurar un resultado confiable en la identificación por masas.
- El gel debe ser manejado con guantes todo el tiempo desde su elaboración hasta su colocación en solución desteñidora para evitar contaminación por queratinas.
- De preferencia entregar a la Unidad el gel completo para su corte dentro de dicho laboratorio y debe estar almacenado en solución desteñidora NO EN AGUA.
Cámara de isoelectroenfoque
Cámara que permite correr al mismo tiempo hasta 12 diferentes tiras de isoelectroenfoque. Permite correr tiras de 7, 13, 18 y 24 cm.
Cámaras de electroforesis de gran formato
Cámaras de electroforesis que permiten correr desde uno hasta 12 geles de gran formato al mismo tiempo (24cm).
Espectrómetro de Masas
MALDI TOF/TOF que permite el análisis de masa de diversas muestras, mediante la absorción asistida por matriz y a través de la incidencia de un láser sobre dicha muestra. Analiza los fragmentos por tiempo de vuelo y puede re-fragmentar los inicialmente fragmentados.
Fotodocumentadores
Equipos que permiten tomar imágenes de los geles de formatos diversos (7, 13, 18, 24cm) teñidos con colorantes visibles como Coomassie o plata y fluorescentes como Sypro, Cy2, Cy3, Cy5, etc.
Cortador de geles
Equipo robotizado que permite el corte de spots de manera automatizada para evitar contaminación por queratina de las muestras a ser analizadas por masas.
